【重磅升級】TMT標記定量蛋白質組告別“搭橋”,“直飛”省時省力省錢

時間:2020-04-29

TMT標記定量蛋白質組學可以表征生物系統中的全部蛋白質,目前已成為解決重要生物學問題的重要工具。然而,基于其技術方面的一些局限,目前仍面臨一定的挑戰,主要包括分析速度、蛋白質組覆蓋深度和定量的質量。

TMTpro 16plex標記試劑是Thermo Fisher Scientific新推出的新一代串聯質譜標簽,可實現一次標記16個樣本,既能提升多重樣品數量,又保證了蛋白檢測高通量和定量質量。以往TMT最高通量是標記11個樣本,但如果您的實驗設計是4組3重復,4組4重復或是5組3重復,那么該如何進行實驗設計?下面我們以4組3重復為例可采取如下方案:
方案1:分成3個標記組,并且增加3個內標“搭橋”,即增加3個混樣內標的標記上機。
A1、B1、C1、D1、內標
A2、B2、C2、D2、內標
A3、B3、C3、D3、內標
該方法需要3次質譜檢測,即降低了檢測速度同時又增加了檢測成本。

方案2:分成2個標記組,將一組樣本隨機分散在不同標記組中。 

A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2
C3、D1、D2、D3  

這種方法增加了數據重復性差的風險,并且也需要2次質譜檢測。


然而有了TMTpro 16plex這一切都不是問題,4組3重復?5組3重復?一次統統搞定,省時省力省錢?。?!OMG,選它!選它??!選它?。?!


2020年3月來自哈佛大學Steven P. Gygi研究組在Nature Methods上發表的題為“TMTpro reagents: a set of isobaric labeling mass tags enables simultaneous proteome-wide measurements across 16 samples”的研究論文,該文介紹了新一代串聯質譜標簽試劑TMTpro,既能提高樣品標記數量(它可實現一次同時標記16個樣品),又能保證蛋白鑒定高通量及質量,可有效解決上述存在的挑戰。下面讓我們具體來看一下TMTpro究竟具有哪些提升。


TMTpro試劑:一組同量異位標記質量標簽,可同時對16個樣品進行蛋白質組范圍的測定



TMTpro試劑和TMT試劑定量能力的表征


作者首先利用人類細胞裂解物對TMTpro試劑和TMT試劑的蛋白定量能力進行了測試,TMTpro標記鑒定到的肽段數比TMT試劑略少,但TMTpro所需的碎裂能量更低,產生的報告離子信號更強。對于其他指標,包括標記效率、m/z的分布、MS2離子注入時間,SEQUEST得分、質量誤差和鑒定肽段的長度,二者之間基本相同。

為了研究TMTpro試劑和TMT試劑的定量精度,作者進一步利用SPS-MS3和hrMS2方法比較了HCT116細胞和293T細胞之間的蛋白質表達差異。研究發現二者具有高度相似的定量性能,并表現出很好的相關性。


圖1 TMT試劑和TMTpro試劑標記樣品的比較



TMTpro試劑可實現對人類蛋白質組進行快速分析

作者使用TMTpro 16plex標記的樣品組研究使用和不使用Torin1處理的八種人類細胞系的蛋白差異表達情況,并結合實時搜索(RTS)方法,在每個重復平均定量了8800個蛋白質(每個蛋白質7.5個肽的平均值),整個蛋白質組分析的總數據采集時間為18 h,每個蛋白質組的分析時間僅為1.1 h。

圖2 TMTpro試劑在用Torin1處理的八種人類細胞系中的應用



TMTpro試劑使復雜的二維蛋白質穩定性檢測方法(PISA)更便利

作者一式五份用DMSO、1和20 μM星形孢菌素(一種廣譜激酶抑制劑)處理HCT116細胞裂解物,并進行了PISA分析。在常規TMT 10plex實驗中,需要以對照組作為實驗之間的橋梁來進行兩次TMT 10plex實驗。而使用TMTpro 試劑,可以在一個15plex實驗中容納對照組和兩個濃度組,從而減少了50%的處理和數據采集時間,并且在各個濃度下基本沒有缺失值。

圖3 TMTpro試劑在二維PISA分析中的應用



小結

TMTpro試劑代表了進一步改進蛋白質組學中樣品多重化的強大起點。其中有幾個值得注意的優點:(1)蛋白質組檢測深度顯著,通過分餾分從細胞或組織中檢測蛋白通常超過8000個;(2)穩定的同位素標記直接支持多重化,同時提供高度準確的相對定量;(3)統計推斷可以在整個系統中得到更大的應用;(4)可以適用更復雜的實驗設計(例如可以在一個TMTpro實驗中安排更多數量的處理和重復實驗)??傊?,新一代TMTpro將推動定量蛋白質組學技術達到前所未有的高通量和覆蓋深度。




TMTpro 16plex技術原理



TMTpro 16plex標簽同常規的TMT 6標、10標一樣,由三部分組成:分子量報告子、分子量標準化部分和反應基團。TMTpro 16plex試劑通過反應基團能夠高效地標記酶解后的肽段。在一級質譜圖中,分子量標準化部分使任何一種TMTpro 16plex試劑標記的不同樣本中的同一肽段表現為相同的質荷比。在串聯質譜中,可剪切臂能夠優先斷裂以便釋放分子量報告子。每個報告子都有各自獨特的分子量,并且能夠在MS/MS分析中反應出所標記的多肽的樣品豐度,根據報告離子的信號強度值可獲得樣品間相同肽段的定量信息,再經過軟件處理得到蛋白質的定量信息。

TMTpro 16plex標簽結構示意圖


TMTpro 16plex試劑工作流程



數據分析流程


技術優勢

靈敏度高:可檢測出低豐度蛋白
分離能力強:可分離出酸/堿性蛋白,小于10KD或大于200KD的蛋白、難溶性蛋白等;

適用范圍廣:可以對任何類型的蛋白質進行鑒定,包括膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白等;

高通量:可同時對16個樣本進行分析,特別適用于采用多種處理方式或來自多個處理時間的樣本的差異蛋白分析; 

結果可靠:定性與定量同步進行,同時給出每一個組分的相對表達水平、分子量和豐富的結構信息;

自動化程度高:液質連用,自動化操作,分析速度快,分離效果好。



應用領域

科研:研究特定疾病發生的遺傳變異,如單基因遺傳病、罕見疾病基因檢測等。

農業:用于品系鑒定、優勢性狀篩選、群體遺傳學分析、親緣關系分析等

動植物:動植物生長發育、抗病、抗逆機制研究以及育種研究。同時可實時更新和補充關聯信息的完整性

醫學:闡釋疾病的發生發展機制,發現與疾病相關的生物標志物,以應用于疾病診斷、治療、預后及用藥研究。


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參考文獻

Li J, Van Vranken JG, Pontano VL, et al. TMTpro reagents: a set of isobaric labeling mass tags enables simultaneous proteome-wide measurements across 16 samples[J]. Nat. Methods, 2020, 17: 399-404.  IF 28.467

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